ПЛР складається з багатьох послідовних етапів, і на кожному з них можуть виникнути певні проблеми. Якщо результат неочікуваний або сумнівний, саме контрольні проби допомагають швидко локалізувати проблему і зрозуміти, на якому етапі вона виникла. В даній статті ми розглянемо їх детальніше.

Негативний контроль (No Template Control, NTC)

Це реакція, що містить усі компоненти ПЛР — полімеразу, праймери, нуклеотиди, буфер — але без цільового фрагмента нуклеїнової кислоти. Якщо в цьому зразку раптом з’являється ампліфікація, це означає, що реактиви або обладнання забруднені сторонньою ДНК/РНК. У такому разі отримані результати слід вважати недійсними.

Позитивний контроль

Це реагент, який гарантовано містить цільовий фрагмент у відомій концентрації (або принаймні його наявність). Якщо він не ампліфікується, можливі причини:

• Пошкоджені чи прострочені реагенти,
• Неправильні умови ПЛР,
• Несправність термоциклера.

Позитивний контроль підтверджує, що реакція в принципі здатна працювати і дає сигнал за зазначених налаштувань ампліфікатора.

Внутрішні контролі (Internal Controls)

Внутрішні контролі це додаткові фрагменти (ендо- чи екзогенні), які ампліфікуються одночасно з цільовим фрагментом. Вони перевіряють коректність реакції у кожній пробірці, використовуючи той самий буфер, dNTP та фермент, що і цільовий фрагмент.

Ендогенний внутрішній контроль

• Це зазвичай стабільно наявний у зразку ген (наприклад, β-актин у людини).
• Демонструє, чи якісно виділена нуклеїнова кислота та чи відсутні інгібітори, що заважають ампліфікації.

Екзогенний внутрішній контроль

• Штучно введений фрагмент нуклеїнової кислоти, якої немає в зразку від початку.
• Зазвичай додається на етапі екстракції, тому дозволяє виявляти проблеми не лише із самою ПЛР, а й із процедурою виділення ДНК/РНК.
• Виробники тест-систем підбирають кількість такого контролю та праймерів, щоб він не «забивав» ампліфікацію цільового фрагмента й не спотворював результати.

Ct (Cycle threshold) із погляду виробників тест-систем

У ПЛР у реальному часі (qPCR) флуоресцентний сигнал фіксується після кожного циклу ампліфікації.

• Ct (Cycle threshold) — це номер циклу, на якому рівень флуоресценції перетинає певний поріг.
• Виробники тест-систем, як правило, надають чіткі рекомендації, у яких межах циклів (наприклад, до 35–38) результат вважається достовірним. Показники вище цих меж можуть вказувати на дуже низьку кількість цільового фрагмента або на технічні артефакти.
• Слід одночасно оцінювати Ct для цільового фрагмента і для внутрішнього контролю, щоб переконатися в належній роботі реакції в кожній конкретній пробірці.

Кількісні стандарти

Коли потрібно знати концентрацію цільового фрагмента (наприклад, для оцінки вірусного навантаження), до ПЛР включають стандартні зразки з відомою кількістю копій. Порівнюючи отриманий Ct із Ct стандартів, ви може розрахувати реальну кількість копій у зразку. Це допомагає у:

• Моніторингу перебігу хвороби,
• Оцінці ефективності терапії,
• Аналіз рівня експрессії генів

Система контролів — невід’ємна частина надійного ПЛР-протоколу. Ми рекомендуємо обирати тест-системи, що містять екзогенний внутрішній контроль, адже це дозволить вам оцінити не лише якість ампліфікації, а й перевірити ефективність екстракції.

Також звертайте увагу на валідацію тест-систем виробником, їх підтверджену чутливість і специфічність. Наявність детальних інструкцій із використання та рекомендацій щодо оптимальних умов реакції допоможе дотримуватися протоколу й отримувати надійні та відтворювані результати.