Як забезпечити надійність ПЛР-аналізу: розбираємося в системі контролів

Негативний контроль

Негативний контроль в ПЛР  містить усі компоненти реакції (полімеразу, праймери, нуклеотиди, буфер) без досліджуваного цільового фрагмента. Наявність ампліфікації в цьому зразку свідчить про контамінацію.У такому разі отримані результати слід вважати недійсними. Варто перевірити реактиви, обладнання та поверхні боксу на забруднення сторонньою ДНК/РНК.

Негативний контроль зворотньої транскрипції

Це РНК і всі компоненти реакції  зворотньої транскрипції, за винятком зворотньої транскриптази. Цей контроль слід ставити, щоб переконатися, що реакція не містить послідовностей, які ампліфікуються в умовах ПЛР без необхідності зворотньої транскрипції.

Позитивний результат може свідчити про те, що зразок містить геномну ДНК, або реакція була забруднена під час постановки, або відбулося утворення димерів праймерів. Для отримання точного  результату слід провести аналіз в поєднанні з негативним контролем.

Позитивний контроль

Це реагент, який гарантовано містить цільовий фрагмент у відомій концентрації (або принаймні його наявність). Позитивний контроль підтверджує, що реакція в принципі здатна працювати і дає сигнал за зазначених налаштувань ампліфікатора. Якщо він не ампліфікується, можливі причини:

• Пошкоджені чи протерміновані реагенти,
• Неправильне зберігання набору,
• Неправильні умови ПЛР,
• Несправність термоциклера.

Внутрішні контролі ПЛР

Внутрішні контролі (IC) —  це додаткові фрагменти нуклеїнових кислот (ендо- чи екзогенні), які ампліфікуються одночасно з цільовим фрагментом. Вони мають перевіряти коректність реакції у кожній пробірці, використовуючи той самий буфер, dNTP та ферменти, що й у цільовому фрагменті.

Ендогенний внутрішній контроль

• Це зазвичай стабільно наявний у зразку ген “домашнього хазяйства” (наприклад, β-актин у людини).
• Демонструє, чи якісно виділена нуклеїнова кислота та чи відсутні інгібітори, що заважають ампліфікації.

Екзогенний внутрішній контроль

• Штучно введений фрагмент нуклеїнової кислоти, якої немає в зразку від початку.
• Зазвичай додається на етапі екстракції, тому дозволяє виявляти проблеми не лише із самою ПЛР, а й із процедурою виділення ДНК/РНК.
• Виробники тест-систем підбирають кількість такого контролю та праймерів, щоб він не зменшував ампліфікацію цільового фрагмента.

Ct або цикл порогу

У ПЛР у реальному часі (qPCR) флуоресцентний сигнал фіксується після кожного циклу ампліфікації. Ct (Cycle threshold) це номер циклу, на якому рівень флуоресценції перетинає встановлений поріг. В даній статті ми відносимо Ct до ПЛР-контролів, оскільки він також дозволяє нам оцінити достовірність реакції.

Чим нижчий Ct, тим вища початкова кількість цільового фрагмента в зразку. Виробники тест-систем, як правило, надають чіткі рекомендації щодо очікуваного діапазону Ct, у межах якого результат вважається достовірним. Для окремих тест-систем це може бути, наприклад, 35–38 циклів. Значення Ct поза цими межами можуть вказувати на низьку концентрацію мішені, технічні артефакти або неефективність реакції. Тому Ct для цільового фрагмента слід оцінювати разом із внутрішнім контролем, а в кількісних форматах — також із Ct стандартів.

Кількісні стандарти

Коли потрібно знати концентрацію цільового фрагмента (наприклад, для оцінки вірусного навантаження), до ПЛР включають стандартні зразки з відомою кількістю копій. Порівнюючи отриманий Ct із Ct стандартів, ви можете розрахувати реальну кількість копій у зразку.

Хоч кількісні стандарти і не є контролем у класичному розумінні, їх Ct також може надати інформацію про перебіг ПЛР-реакції. Якщо Ct перевищує очікуваний виробником діапазон значень, ми можемо говорити про неефективність реакції (25 цикл замість очікуваного 23-го, наприклад). В такому випадку зверніть увагу на підготовку суміші і умови реакції. Додатковим інструментом оцінки може бути нахил (slope) стандартних кривих.

Якщо у вас між Ct кількісних стандартів нерівномірні проміжки, це може свідчити про помилки піпетування або про наявність інгібіторів ПЛР. Інгібітори легко детектуввати, якщо у вас спостерігається зменшена різниця Ct відносно інших кривих між першим і другим стандартами.

Як визначити помилку за допомогою контролів в ПЛР

Є сигнал у негативному контролі

Це може свідчити про контамінацію реагентів, витратних матеріалів або робочої зони. У такому разі варто перевірити чистоту зони постановки, розхідні матеріали, приготування сумішей і, за потреби, замінити реагенти.

Немає сигналу в позитивному контролі

Це може означати проблему з реагентами, параметрами реакції або роботою приладу. Слід перевірити термін придатності реагентів, умови їх зберігання, програму ампліфікації та калібрування термоциклера.

Не визначаються ані цільова мішень, ані внутрішній контроль

Це може бути пов’язано з наявністю інгібіторів ПЛР, проблемами екстракції або недостатньою кількістю нуклеїнової кислоти. У такому разі варто перевірити якість зразка, етап виділення та за потреби розглянути повторну екстракцію.

Ct кількісних стандартів менше очікуваного

Це може свідчити про зависоку концентрацію ДНК. Також не можна виключати контамінацію. Такі результати слід оцінювати разом із позитивним і внутрішнім екзогенним контролем.

Ct кількісних стандартів більше очікуваного

Це може бути пов’язано з деструкцією ДНК під час екстракції або з низькою концентрацією ДНК у зразку. Такі результати також варто аналізувати в тандемі з позитивним і внутрішнім екзогенним контролем.

Ct внутрішнього контролю більше очікуваного в негативному зразку

Можливі причини: неправильне налаштування термоциклера, надлишок інгібіторів, втрата нуклеїнової кислоти під час екстракції або невідповідний матеріал зразка, наприклад, гепаринова плазма.